斑(ban)馬(ma)魚(yu)胚(pei)胎顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)實驗操(cao)作(zuo)方法(fa)

顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)技(ji)術(shu)是(shi)在顯(xian)微(wei)鏡(jing)下，利(li)用顯(xian)微(wei)操(cao)作(zuo)系統，控制(zhi)顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)針(zhen)在顯(xian)微(wei)鏡(jing)視(shi)野(ye)內移(yi)動(dong)，對進行細(xi)胞(bao)或早(zao)期(qi)胚胎操(cao)作(zuo)的壹種(zhong)方法(fa)。該技(ji)術(shu)已(yi)經(jing)在越來(lai)越多的實驗生物(wu)學(xue)研(yan)究(jiu)領(ling)域中成為壹項(xiang)普(pu)遍的(de)操(cao)作(zuo)技(ji)術(shu)，並成功(gong)運(yun)用於(yu)包括(kuo)小(xiao)鼠(shu)、大鼠、兔(tu)子(zi)、斑(ban)馬(ma)魚(yu)及(ji)許多大型家(jia)畜，如(ru)牛、羊(yang)、豬等(deng)動(dong)物(wu)中。

斑(ban)馬(ma)魚(yu)顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)是(shi)將實驗材(cai)料直(zhi)接(jie)註(zhu)射(she)到1-4細(xi)胞(bao)期(qi)的斑(ban)馬(ma)魚(yu)胚(pei)胎中，由(you)於(yu)在這(zhe)個(ge)胚胎發(fa)育早(zao)期(qi)沒有膜分(fen)隔細(xi)胞(bao)和卵黃(huang)，註入1個(ge)細(xi)胞(bao)或卵黃(huang)的溶液(ye)將擴散(san)到整(zheng)個(ge)胚胎中。通(tong)過(guo)註(zhu)射(she)不(bu)同(tong)類(lei)型的(de)實驗樣(yang)品，實現基因(yin)的(de)瞬(shun)時過(guo)表(biao)達（over-expression）、表(biao)達敲減（knock-down）、以及制備(bei)轉(zhuan)基因(yin)或突(tu)變斑(ban)馬(ma)魚(yu)品(pin)系等(deng)研(yan)究(jiu)。

壹、   胚(pei)胎顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)技(ji)術(shu)的(de)應用

斑(ban)馬(ma)魚(yu)作(zuo)為壹種(zhong)新(xin)興的理想的(de)模式生物(wu)，在生命(ming)科(ke)學(xue)研(yan)究(jiu)中已(yi)得(de)到廣(guang)泛(fan)應用，斑(ban)馬(ma)魚(yu)胚(pei)胎顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)技(ji)術(shu)是(shi)這(zhe)些應用研(yan)究(jiu)的(de)基礎技(ji)術(shu)平(ping)臺之(zhi)壹。通(tong)過(guo)顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)不(bu)同(tong)的(de)實驗樣(yang)品，可(ke)以實現以下不(bu)同(tong)的(de)目的(de)。

（壹）可(ke)以通(tong)過(guo)註(zhu)射(she)體(ti)外合(he)成的(de)mRNA實現目的(de)基因(yin)的(de)過(guo)表(biao)達，並通(tong)過(guo)觀(guan)察(cha)表(biao)型推(tui)測(ce)目的(de)基因(yin)的(de)功(gong)能。

（二）可(ke)以通(tong)過(guo)註(zhu)射(she)反(fan)義(yi)嗎啉(lin)環寡核苷酸（morpholino）敲(qiao)減目的(de)基因(yin)的(de)表(biao)達。morpholino是(shi)穩(wen)定的(de)人(ren)工合(he)成的(de)核(he)酸類(lei)似物(wu)，通(tong)過(guo)標(biao)準(zhun)的(de)堿(jian)基互(hu)補(bu)配(pei)對與(yu)mRNA結合(he)，阻(zu)斷(duan)蛋白翻(fan)譯或mRNA剪切(qie)。與(yu)過(guo)表(biao)達相反(fan)，這(zhe)種(zhong)方法(fa)導(dao)致mRNA蛋白產物(wu)減少(shao)，可(ke)以通(tong)過(guo)該蛋白減少(shao)時對生物(wu)學(xue)過(guo)程(cheng)的(de)改(gai)變(bian)來(lai)解(jie)釋(shi)目的(de)基因(yin)在發(fa)育中所(suo)扮(ban)演的角(jiao)色(se)。

（三）基因(yin)敲(qiao)除（knock-out）品(pin)系的研制。基因(yin)敲(qiao)除品(pin)系是(shi)在活體(ti)動(dong)物(wu)上開展基因(yin)功(gong)能研(yan)究(jiu)的(de)重要(yao)工具(ju)。CRISPR-Cas9技(ji)術(shu)是(shi)壹種(zhong)高(gao)效(xiao)、快(kuai)速(su)的(de)構建(jian)敲(qiao)除品(pin)系的新(xin)方法(fa)。這(zhe)個(ge)技(ji)術(shu)的(de)原理是(shi)通(tong)過(guo)人(ren)工(gong)設(she)計(ji)出sgRNA，sgRNA能夠(gou)通(tong)過(guo)堿(jian)基配(pei)對(dui)識(shi)別目標(biao)序列，然(ran)後(hou)引(yin)導(dao)體(ti)外合(he)成的(de)核(he)酸內(nei)切(qie)酶(mei)Cas9蛋白在目標(biao)靶點(dian)產生切(qie)割。DNA斷(duan)裂(lie)後(hou)，細(xi)胞(bao)將通(tong)過(guo)非(fei)同(tong)源(yuan)末(mo)端接(jie)合(he)(NHEJ)修復機制來(lai)進(jin)行修復，將斷(duan)裂(lie)的DNA重新(xin)連(lian)接(jie)起(qi)來(lai)，在這(zhe)個(ge)過(guo)程(cheng)中會(hui)產生DNA堿基的(de)插入或缺失的(de)錯(cuo)誤，從(cong)而引(yin)起(qi)DNA突(tu)變。

（四(si)）轉(zhuan)基因(yin)品(pin)系的研制。轉(zhuan)基因(yin)技(ji)術(shu)是(shi)將人工分離和修飾(shi)過(guo)的(de)基因(yin)導(dao)入(ru)到生物(wu)體(ti)基因(yin)組(zu)中，由(you)於(yu)導(dao)入(ru)基因(yin)的(de)表(biao)達，引起(qi)生物(wu)體(ti)的(de)性狀(zhuang)產生可(ke)遺(yi)傳(chuan)的修飾(shi)。在轉(zhuan)基因(yin)品(pin)系研制中，轉(zhuan)基因(yin)載(zai)體(ti)是(shi)承載(zai)外源(yuan)基因(yin)，攜(xie)帶靶基因(yin)進(jin)入(ru)斑(ban)馬(ma)魚(yu)胚(pei)胎細(xi)胞(bao)，並將目的(de)基因(yin)整(zheng)合(he)到斑(ban)馬(ma)魚(yu)基因(yin)組(zu)使(shi)其(qi)穩(wen)定維(wei)持(chi)的(de)DNA分(fen)子(zi)。顯微(wei)註(zhu)射(she)是(shi)制(zhi)備(bei)轉(zhuan)基因(yin)斑(ban)馬(ma)魚(yu)過(guo)程(cheng)中常用的(de)方法(fa)。

二、 顯微(wei)註(zhu)射(she)系統的搭(da)建(jian)

斑(ban)馬(ma)魚(yu)顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)需(xu)有(you)壹套(tao)相當精密的顯微(wei)操(cao)作(zuo)設備(bei)，主(zhu)要(yao)包(bao)括以下幾(ji)種(zhong)（圖4.1）：

圖4.1顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)常用設(she)備(bei)。A: SUTTERP-1000微(wei)電(dian)極拉制儀(yi); B: ASI顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)儀(yi)MPPI-3;

C: 持針器(qi)和顯微(wei)操(cao)作(zuo)儀MM33; D：體視(shi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)

微(wei)電(dian)極拉制儀(yi)用於(yu)拉制毛細(xi)管成註(zhu)射(she)針，可(ke)以調(tiao)節的(de)溫(wen)度(du)、拉力、拉制時間等(deng)參(can)數拉制出(chu)合(he)適針尖的註(zhu)射(she)針，為了防(fang)止(zhi)空(kong)氣(qi)中灰(hui)塵顆粒沾(zhan)染(ran)註(zhu)射針引(yin)起(qi)針尖阻(zu)塞(sai)，註射(she)針現用現拉。

顯微(wei)註(zhu)射(she)儀(yi)用於(yu)註射(she)針(zhen)內(nei)的溶液施加(jia)壓力脈沖(chong)，利(li)用可(ke)調節氣(qi)壓脈沖(chong)將精準(zhun)體(ti)積(ji)的(de)樣(yang)品註(zhu)射至胚胎體(ti)內(nei)。註射器(qi)還(hai)和壹個(ge)腳(jiao)踏(ta)板(ban)相連，使得(de)實驗人員(yuan)在使(shi)用雙(shuang)手的(de)同(tong)時還(hai)可(ke)以激(ji)活壓力脈沖(chong)將實驗材(cai)料註(zhu)射入(ru)胚胎中；

持(chi)針器用於(yu)固(gu)定在註(zhu)射過(guo)程(cheng)中使(shi)用的(de)註射(she)針(zhen)，並將它與(yu)註(zhu)射器的(de)空氣管相連，常裝(zhuang)在顯(xian)微(wei)操(cao)作(zuo)器上；

顯(xian)微(wei)操(cao)作(zuo)儀用於(yu)註射(she)針(zhen)的(de)顯微(wei)操(cao)縱，可(ke)以在顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)過(guo)程(cheng)中對(dui)註射針(zhen)的(de)位置(zhi)進行細(xi)小(xiao)和精準(zhun)地調(tiao)節；

體(ti)視(shi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)用於(yu)顯微(wei)註(zhu)射(she)時觀察胚(pei)胎，可(ke)以在顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)過(guo)程(cheng)中看到胚(pei)胎並對註(zhu)射(she)針所(suo)在的(de)位置(zhi)聚焦。

三、 顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)過(guo)程(cheng)及(ji)註(zhu)意(yi)事(shi)項

顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)技(ji)術(shu)是(shi)壹個(ge)相對精細(xi)的(de)實驗操(cao)作(zuo)，主要有(you)以(yi)下步(bu)驟(zhou)。

（壹）準(zhun)備(bei)註(zhu)射(she)用的(de)胚胎

註(zhu)射(she)的前1DAY，按照(zhao)雌(ci):雄為1:1或2 :1的比(bi)例將成年(nian)斑(ban)馬(ma)魚(yu)放(fang)置(zhi)於配(pei)種(zhong)缸，用隔(ge)板(ban)分開（圖2.3）。

註(zhu)射的早(zao)上，抽(chou)去(qu)隔板(ban)，雌(ci)雄魚開始交配(pei)。壹般(ban)在十多分鐘(zhong)左右親魚(yu)產卵並使卵(luan)受精。壹般(ban)壹次抽板(ban)2缸魚左右，隨(sui)後(hou)根(gen)據(ju)實驗進度(du)適時給(gei)其(qi)它缸抽板(ban)。可(ke)在抽(chou)板(ban)前先將內缸連同(tong)親(qin)魚(yu)換到另壹幹(gan)凈(jing)外缸中以(yi)節約清(qing)潔胚胎的(de)時間。

親魚(yu)產卵後(hou)，取(qu)180μm孔(kong)徑(jing)的過(guo)濾(lv)網(wang)，收集外缸底部(bu)的魚(yu)卵(luan)，並用養(yang)殖(zhi)水(shui)清(qing)洗(xi)魚卵(luan)2-3次。應盡量收(shou)集20 min內(nei)的(de)受精卵（即(ji)對(dui)於同(tong)壹缸親魚(yu)，兩次收集受精卵的(de)時間間隔(ge)不(bu)得(de)超(chao)過(guo)20分(fen)鐘(zhong)，以保證(zheng)發(fa)育階(jie)段(duan)的壹致(zhi)性(xing)）。受精卵分(fen)選和洗(xi)凈(jing)後(hou)，用吸管將收集的(de)卵(luan)置(zhi)於平(ping)板(ban)培養(yang)皿(min)中，去(qu)除平(ping)皿內(nei)的異物(wu)和胚胎周(zhou)圍的(de)水(shui)，采用幹(gan)法(fa)註(zhu)射。

胚胎在受精後(hou)10分(fen)鐘(zhong)卵膜(mo)將膨(peng)脹，隨(sui)後(hou)數分鐘(zhong)內細(xi)胞(bao)形態(tai)變(bian)得(de)較為規整（容(rong)易(yi)找(zhao)到動(dong)物(wu)極），此時可(ke)以開始註射(she)。受精後(hou)45分(fen)鐘(zhong)左右（標準(zhun)培育溫(wen)度(du)下所(suo)需(xu)時間，具體(ti)情(qing)況同(tong)室(shi)溫(wen)有(you)關）發(fa)生壹次卵裂(lie)。樣(yang)品通(tong)常需(xu)要(yao)註射到1-4細(xi)胞(bao)時期(qi)胚胎，以(yi)下上樣(yang)、斷(duan)針、定量(liang)和註射(she)都(dou)要(yao)在此(ci)段時間內或在此(ci)之前完(wan)成。

（二）拉針、上樣(yang)和儀器(qi)準(zhun)備(bei)工(gong)作(zuo)

1、拉針。使(shi)用微(wei)電(dian)極拉制儀(yi)拉制壹定數量的(de)毛細(xi)管，應提前準(zhun)備(bei)。

2、可(ke)以提(ti)前準(zhun)備(bei)，樣(yang)品通(tong)常包括質(zhi)粒DNA、RNA、morpholino等(deng)。

DNA質(zhi)粒樣(yang)品：質(zhi)粒DNA需(xu)使(shi)用“去(qu)內毒(du)。素"的試(shi)劑(ji)盒(he)提(ti)取(qu)。壹般(ban)註(zhu)射量(liang)為每枚胚(pei)胎20-150pg，多於200pg胚胎死(si)亡率(lv)上升(sheng)。

mRNA樣(yang)品：壹般(ban)註(zhu)射量(liang)為每枚胚(pei)胎10-500pg，針(zhen)對(dui)不同(tong)的(de)mRNA樣(yang)品，需(xu)要(yao)摸(mo)索各(ge)自(zi)適宜(yi)的濃度(du)。

Morpholino樣(yang)品：參(can)見(jian)GeneTools公(gong)司(si)隨(sui)樣(yang)品提(ti)供的說(shuo)明(ming)書。通(tong)常產品總(zong)量(liang)為300nmol壹瓶，約相當於2400μg，加(jia)入(ru)200μL滅過(guo)菌的去(qu)離子(zi)水（電(dian)阻(zu)率>18MΩ/cm）稀(xi)釋(shi)至(zhi)12μg/μL，每(mei)管20μL分(fen)裝(zhuang)作(zuo)為儲液(ye)凍存(cun)在－20℃。註(zhu)射時取壹管稀(xi)釋(shi)至(zhi)0.5-6μg/μL (ng/nL)左右。針對(dui)不同(tong)的(de)morpholino，需(xu)摸(mo)索各(ge)自(zi)合(he)適的濃度(du)，以(yi)獲(huo)得(de)理想(xiang)的(de)表(biao)型而(er)不(bu)產生毒(du)性效應為宜(yi)。在使(shi)用新(xin)的(de)morpholino時，必(bi)須慎重考量(liang)該morpholino的有效(xiao)性和特(te)異(yi)性(xing)。

所(suo)有(you)樣(yang)品使(shi)用前需(xu)要(yao)先離心(xin)，使(shi)可(ke)能存(cun)在的(de)固(gu)體(ti)懸(xuan)浮(fu)物(wu)沈(chen)澱(dian)到管底(di)，避免堵住(zhu)針頭(tou)。壹般(ban)可(ke)以在註(zhu)射樣(yang)品中加(jia)入終濃度(du)10%-20%的(de)酚(fen)紅，便(bian)於(yu)觀察(cha)註(zhu)射(she)過(guo)程(cheng)。

3、上樣(yang)裝(zhuang)針(zhen)。將拉制好的毛細(xi)管豎(shu)直(zhi)固(gu)定。然(ran)後(hou)吸取(qu)1-3μl顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)液(ye)，逐(zhu)滴地將註射液滴(di)在毛細(xi)管頂端(duan)，在毛細(xi)管內(nei)芯(xin)引導下，液(ye)體(ti)通(tong)過(guo)虹(hong)吸作(zuo)用將匯聚於(yu)玻璃(li)管針(zhen)頭(tou)部(bu)分。如(ru)果(guo)使用的(de)毛細(xi)管沒(mei)有(you)內芯，可(ke)以使(shi)用微(wei)量(liang)上樣(yang)移液(ye)槍頭(tou)上樣(yang)。上樣(yang)體積(ji)至(zhi)少(shao)為1μL，壹定不(bu)要(yao)在針(zhen)內引(yin)入空(kong)氣(qi)柱，否則(ze)會(hui)難(nan)以(yi)控制(zhi)註(zhu)射量(liang)。

4、打開顯微(wei)註(zhu)射(she)儀(yi)。以MPPI-3脈沖(chong)壓力註射儀為例。打開氮(dan)氣(qi)罐(guan)總(zong)閥，調(tiao)節壓力至0-0.5之間。打開註射儀(yi)開關，調節主(zhu)操(cao)作(zuo)面(mian)板(ban)上的(de)壓力值(zhi)為10-20左右，選擇合(he)適的註射(she)壓力和脈沖(chong)時間。（圖4.2）

圖4.2 全(quan)套搭(da)建(jian)好的顯微(wei)註(zhu)射(she)設(she)備(bei)（左側）和破針(zhen)操(cao)作(zuo)（右側）

（三）註(zhu)射斑(ban)馬(ma)魚(yu)胚(pei)胎

1、破(po)針(zhen)。將上好樣(yang)品的(de)註射針插入持(chi)針器(qi)中固(gu)定，然(ran)後(hou)在體(ti)視(shi)鏡(jing)高(gao)倍(bei)放(fang)大(da)率下，用尖頭(tou)鑷(nie)子(zi)將註射針的(de)前端夾斷(duan)。（圖4.2）

2、註(zhu)射劑量調(tiao)整。把臺微(wei)尺(chi)放(fang)置(zhi)到體(ti)視(shi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)下，加(jia)入(ru)壹滴(di)礦(kuang)物(wu)油(you)，將註射針伸(shen)入(ru)礦(kuang)物(wu)油(you)中，踩(cai)動(dong)踏(ta)板(ban)壓將壹滴(di)註(zhu)射液(ye)送到礦(kuang)物(wu)油(you)，測(ce)量(liang)註(zhu)射樣(yang)品的(de)大小。註射體積(ji)與(yu)針(zhen)尖大小(xiao)、註(zhu)射壓力、註射時間、溶液(ye)粘(zhan)度(du)和外部(bu)壓力有關，理想(xiang)的註(zhu)射(she)劑(ji)量(liang)為胚胎體(ti)積(ji)的(de)10%，壹般(ban)為1nL（註射(she)樣(yang)品的(de)直徑在10個(ge)小格(ge)左右）。註射(she)劑量過(guo)大(da)體(ti)積(ji)會(hui)損(sun)傷(shang)胚胎，過(guo)小(xiao)可(ke)能影(ying)響定量(liang)精(jing)準(zhun)度(du)和擴散(san)的(de)均勻程度(du)。

3、註(zhu)射(she)。將收集的(de)胚(pei)胎放(fang)置(zhi)到體(ti)視(shi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)鏡(jing)下，用低(di)倍(bei)物(wu)鏡(jing)對(dui)準(zhun)胚(pei)胎調(tiao)焦，輕輕的落下針(zhen)尖，並將註射針尖推入(ru)視(shi)野(ye)中心(xin)，通(tong)過(guo)微(wei)操(cao)作(zuo)系統的微(wei)調(tiao)調(tiao)整(zheng)註射針(zhen)位置(zhi)，直到清(qing)晰見(jian)到針(zhen)尖為止(zhi)。進(jin)壹步(bu)調(tiao)整顯(xian)微(wei)鏡(jing)焦距(ju)和註射(she)針(zhen)及(ji)胚胎的(de)位置(zhi)，使胚(pei)胎和註射(she)針(zhen)尖均達到非(fei)常清(qing)晰程(cheng)度(du)。推(tui)動(dong)操(cao)縱桿(gan)，小(xiao)心(xin)進(jin)針(zhen)，使註(zhu)射針(zhen)針(zhen)尖進入(ru)胚(pei)胎。腳(jiao)踏(ta)開關將樣(yang)品註(zhu)入胚胎。實驗結束(shu)時，先關閉氮(dan)氣(qi)罐(guan)總(zong)閥（逆(ni)時針變松(song)為關），排(pai)空(kong)儀器中的(de)氣體後(hou)，關閉總(zong)開關。

（四）註(zhu)射胚(pei)胎的(de)培養(yang)和觀察(cha)

1、胚(pei)胎養(yang)殖(zhi)。註(zhu)射結束(shu)後(hou)，將胚胎轉(zhuan)移至(zhi)養(yang)殖(zhi)水(shui)中，置(zhi)入28?C培養(yang)箱(xiang)培養(yang)。待(dai)胚(pei)胎發(fa)育2小(xiao)時後(hou)，顯(xian)微(wei)鏡(jing)下挑(tiao)出(chu)未受精的胚(pei)胎和死(si)亡的(de)胚(pei)胎。孵(fu)化(hua)期(qi)間每天要(yao)及時去(qu)除敗(bai)育胚(pei)胎，勤(qin)換水。

2、胚(pei)胎麻醉和固(gu)定。麻醉劑可(ke)以使(shi)魚(yu)類(lei)代謝(xie)減緩(huan)，鰓動(dong)頻率(lv)下降(jiang)，氧(yang)的需(xu)求(qiu)量減少(shao)，從(cong)而方便進行實驗操(cao)作(zuo)。通(tong)常將斑(ban)馬(ma)魚(yu)浸(jin)泡(pao)於0.016%的Tricaine中進(jin)行麻醉。待(dai)胚(pei)胎麻醉後(hou)，利(li)用4%的(de)甲(jia)基纖(xian)維(wei)素固(gu)定胚(pei)胎，將胚胎調(tiao)整(zheng)到合(he)適的位置(zhi)。廢棄(qi)的顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)針(zhen)的尖兒端(duan)燒(shao)溶後(hou)可(ke)以用於(yu)調整(zheng)胚(pei)胎。

3、胚(pei)胎觀(guan)察(cha)。為了便(bian)於觀(guan)察(cha)顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)的(de)結果，本(ben)次培訓使用質(zhi)粒pT2(tpma:EGFP)和chordin mopholino作(zuo)為註射(she)練習的(de)材(cai)料。質(zhi)粒pT2(tpma:EGFP)註(zhu)射(she)後(hou)，胚(pei)胎發(fa)育至(zhi)1天(tian)時，在肌肉(rou)中特(te)異(yi)表(biao)達綠色(se)熒光(guang)蛋白；chordin mopholino註射後(hou)的(de)胚(pei)胎出(chu)現腹部(bu)化(hua)（ventralization）。（圖4.3）

圖4.3 顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)後(hou)24hpf胚(pei)胎的(de)照(zhao)片。胚(pei)胎發(fa)育至(zhi)1天(tian)時，註射質(zhi)粒pT2(tpma:EGFP)的(de)胚(pei)胎在肌肉(rou)細(xi)胞(bao)中特(te)異(yi)表(biao)達綠色(se)熒光(guang)蛋白（A）；註射chordin mopholino的(de)胚胎產生腹部(bu)化(hua)表(biao)型（B）。

顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)的(de)註意(yi)事(shi)項

顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)的(de)操(cao)作(zuo)過(guo)程(cheng)中有(you)許多細(xi)節影(ying)響實驗的成功(gong)率，需(xu)要(yao)特(te)別關註，主(zhu)要包(bao)括(kuo)以(yi)下幾(ji)方面(mian)。

1、註(zhu)射(she)樣(yang)品的(de)質(zhi)量和和濃度(du)。顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)的(de)樣(yang)品種(zhong)類繁(fan)多，包括mRNA、DNA或蛋白質(zhi)等(deng)，但(dan)是(shi)註(zhu)射樣(yang)品是(shi)否(fou)純凈(jing)是(shi)關系到註(zhu)射(she)效率(lv)高(gao)低(di)的(de)重要(yao)因素之壹。此(ci)外，註(zhu)射(she)樣(yang)品的(de)濃度(du)不(bu)易(yi)太(tai)高(gao)，例(li)如(ru)註(zhu)射DNA的總濃度(du)壹般(ban)控制(zhi)在200pg以(yi)下。

2、註(zhu)射(she)前小心(xin)將顯微(wei)註(zhu)射(she)針(zhen)定位，註(zhu)射(she)針(zhen)定位到卵(luan)表(biao)面(mian)的(de)註(zhu)射(she)角(jiao)度(du)是(shi)穿(chuan)透(tou)堅(jian)硬的(de)卵(luan)殼註(zhu)射(she)成功(gong)的關鍵(jian)。

3、破(po)針時，將針尖壹點(dian)點(dian)剪(jian)斷(duan)，不宜(yi)壹次剪太(tai)多。顯微(wei)註(zhu)射(she)針(zhen)尖如果(guo)太(tai)粗(cu)，會(hui)導致(zhi)DNA流(liu)量過(guo)多，受精卵易(yi)於(yu)裂(lie)解；太(tai)細(xi)則(ze)導致針內(nei)DNA流(liu)出速(su)率(lv)過(guo)慢(man)，且(qie)易(yi)堵(du)塞(sai)針尖，而使(shi)DNA無(wu)法(fa)順利(li)流(liu)入，影(ying)響註(zhu)射效(xiao)率。因此進(jin)行顯微(wei)註(zhu)射(she)時，如何(he)制(zhi)備(bei)適用的(de)顯微(wei)註(zhu)射(she)針(zhen)是(shi)顯(xian)微(wei)註(zhu)射(she)效(xiao)率極其(qi)重要(yao)的因(yin)素。

4、在註(zhu)射過(guo)程(cheng)中，常發(fa)生註射(she)針堵(du)塞(sai)，堵塞(sai)後(hou)，通(tong)常可(ke)通(tong)過(guo)輕(qing)夾針尖、增大(da)輸(shu)出壓力或按pulse/CONT開關而得(de)以緩(huan)解(jie)。如(ru)果(guo)不能解(jie)決，換用新(xin)的(de)註射針(zhen)。

5、註(zhu)射(she)時註射器(qi)的(de)壓力不宜(yi)變化(hua)太(tai)快(kuai)，否則會(hui)造(zao)成註(zhu)射(she)量操(cao)作(zuo)難(nan)以(yi)控制(zhi)，導(dao)致胚(pei)胎內(nei)環(huan)境改變(bian)過(guo)快(kuai)過(guo)大(da)甚(shen)至(zhi)脹(zhang)破細(xi)胞(bao)。氮(dan)氣(qi)罐(guan)的(de)壓力閥顯(xian)示(shi)氣體的壓力，壓力為0表(biao)明罐(guan)內無(wu)氣體，需(xu)要(yao)及時換氣。

6、註(zhu)射完(wan)畢，慢慢(man)抽出註射(she)針，要(yao)壹氣(qi)呵成，避免受精卵內(nei)物(wu)質(zhi)隨(sui)著(zhe)毛細(xi)針(zhen)抽出，造(zao)成受精卵的(de)損(sun)傷(shang)。

7、在整(zheng)個過(guo)程(cheng)中，嚴(yan)禁(jin)將註射針尖對著(zhe)人(ren)員(yuan)和儀器(qi)，因(yin)為註射(she)針在持(chi)針器(qi)上安裝(zhuang)不(bu)牢(lao)時或針尖堵塞(sai)，註射(she)器、管子(zi)及註(zhu)射(she)針(zhen)內的壓力，可(ke)能將註射針射(she)出(chu)傷(shang)人。