將(jiang)外源(yuan)基因(yin)導入靶細(xi)胞(bao)的(de)方法(fa)有(you)很多，其(qi)中壹(yi)種(zhong)比(bi)較(jiao)普(pu)適(shi)、成功(gong)率(lv)又比較高的(de)方法(fa)為(wei)顯微(wei)註(zhu)射法(fa)。

首先(xian)，我(wo)們說(shuo)說這(zhe)種(zhong)方(fang)法(fa)的(de)原理(li)：顯微(wei)註(zhu)射法(fa)即(ji)是(shi)利(li)用(yong)管尖極細(xi)（0.1至(zhi)0.5μm）的(de)玻璃微(wei)量註(zhu)射針，將(jiang)外源(yuan)基因(yin)片(pian)段直(zhi)接(jie)註(zhu)射到(dao)原核期(qi)胚(pei)或(huo)培養的(de)細(xi)胞(bao)中，然(ran)後(hou)藉由宿主(zhu)基因(yin)組(zu)序(xu)列可能發生(sheng)的(de)重組(zu)、缺(que)失(shi)、復(fu)制(zhi)或(huo)易位等(deng)現象(xiang)而使(shi)外源(yuan)基因(yin)嵌(qian)入宿主(zhu)的(de)染色體內，實(shi)現宿主(zhu)細(xi)胞(bao)的(de)基因(yin)改(gai)造(zao)。

壹(yi)般的(de)動物(wu)細(xi)胞(bao)，直徑(jing)大約(yue)10微(wei)米左右(you)；人(ren)類(lei)真(zhen)核細(xi)胞(bao)直徑(jing)範圍在(zai)：3～30微(wei)米，其(qi)中人(ren)卵(luan)細(xi)胞(bao)直徑(jing)約(yue)為(wei)100微(wei)米。故直(zhi)徑(jing)為(wei)0.2微(wei)米的(de)顯微(wei)註(zhu)射器(qi)針頭可以為(wei)各種(zhong)類(lei)型(xing)和任意大小(xiao)的(de)動物(wu)細(xi)胞(bao)提供精準(zhun)的(de)、重復(fu)性良好的(de)細(xi)胞(bao)內和細(xi)胞(bao)旁註射。在(zai)註(zhu)射的(de)過程(cheng)中，動物(wu)細(xi)胞(bao)膜(mo)也(ye)會(hui)被(bei)刺(ci)破。但(dan)因(yin)為(wei)動物(wu)細(xi)胞(bao)膜(mo)良好的(de)彈性和流動性，在(zai)細(xi)胞(bao)膜(mo)被(bei)刺(ci)破以(yi)及(ji)細(xi)胞(bao)內註入或(huo)者(zhe)抽取點(dian)物(wu)質之後，細(xi)胞(bao)膜(mo)還(hai)是(shi)可以恢(hui)復完(wan)整(zheng)的(de)，恢(hui)復好的(de)細(xi)胞(bao)可以繼(ji)續存活(huo)，正常生(sheng)長。當(dang)然(ran)操(cao)作(zuo)手法(fa)也會影響實(shi)驗的(de)成功(gong)率(lv)，針對不(bu)同(tong)細(xi)胞(bao)的(de)操(cao)作(zuo)手法(fa)方面(mian)的(de)研究(jiu)，現在(zai)也(ye)有(you)很多文章發(fa)表出來。

顯微(wei)註(zhu)射技(ji)術(shu)的(de)長處(chu)為(wei)：任何(he)DNA在(zai)原(yuan)則上(shang)均(jun)可傳入任何(he)種(zhong)類(lei)的(de)動物(wu)細(xi)胞(bao)內，對於(yu)所轉的(de)外源(yuan)基因(yin)沒(mei)有(you)長度(du)上(shang)的(de)限(xian)制(zhi)，目(mu)前(qian)已(yi)證明(ming)數百(bai)kb的(de)DNA片(pian)段均(jun)可以成功(gong)轉入靶細(xi)胞(bao)並整(zheng)合進(jin)其(qi)染色體組。操(cao)作(zuo)過程(cheng)如圖所示：

接(jie)下來，我(wo)們再(zai)說說(shuo)顯微(wei)註(zhu)射器(qi)針頭的(de)制(zhi)作(zuo)：顯微(wei)註(zhu)射過(guo)程(cheng)中使(shi)用(yong)的(de)微(wei)量移(yi)液管是(shi)用(yong)微(wei)電(dian)極拉(la)制(zhi)儀(yi)來制(zhi)作(zuo)的(de)，先(xian)將(jiang)玻璃毛細(xi)管加熱到(dao)其(qi)熔化(hua)的(de)溫(wen)度，再(zai)將(jiang)其(qi)拉(la)制(zhi)成所需的(de)合適(shi)大小(xiao)的(de)直徑(jing)和錐(zhui)形，微(wei)量移(yi)液管小頭的(de)直徑(jing)（小至0.2微(wei)米）與(yu)纖維操(cao)縱(zong)器(qi)的(de)高精度相關，它(ta)可以用(yong)於(yu)精準(zhun)的(de)移(yi)液。

   SUTTER微(wei)電(dian)極拉(la)制(zhi)儀(yi)P-000                                                日本NARISHIGE拉(la)制(zhi)儀(yi)PC-100

顯微(wei)註(zhu)射器(qi)的(de)結構(gou)如下圖所示：

註(zhu)射器(qi)中加好需(xu)要註射的(de)樣(yang)品之後，通(tong)過運用(yong)顯微(wei)註(zhu)射儀(yi)（壓(ya)力(li)註(zhu)射）可以獲得將(jiang)微(wei)量移(yi)液管中的(de)物(wu)質擠(ji)噴入靶細(xi)胞(bao)中。

日本NARISHIGE顯微(wei)註(zhu)射儀(yi)IM-400                                                        美(mei)國warner顯微(wei)註(zhu)射儀(yi)PLI-100A

現在(zai)，我(wo)們來歸納壹(yi)下顯微(wei)註(zhu)射法(fa)的(de)應(ying)用(yong)：

（壹(yi)）顯微(wei)註(zhu)射法(fa)可用(yong)來做轉基因(yin)動物(wu)：顯微(wei)註(zhu)射技(ji)術(shu)是(shi)利(li)用(yong)顯微(wei)操(cao)作(zuo)系統和顯微(wei)註(zhu)射技(ji)術(shu)將(jiang)外源(yuan)目(mu)的(de)基因(yin)直(zhi)接(jie)註(zhu)入到(dao)受精卵的(de)原核中，使(shi)外源(yuan)基因(yin)整(zheng)合到(dao)受體細(xi)胞(bao)的(de)基因(yin)組(zu)內，再(zai)通過(guo)胚胎(tai)移(yi)植技(ji)術(shu)將(jiang)整合有(you)外源(yuan)基因(yin)的(de)受精卵移(yi)植到(dao)受體動物(wu)的(de)孑宮(gong)內發育(yu)，從而(er)獲得轉基因(yin)動物(wu)。顯微(wei)註(zhu)射法(fa)是(shi)目(mu)前(qian)轉移(yi)效率(lv)基較(jiao)好的(de)壹(yi)種(zhong)基因(yin)轉移(yi)方法(fa)，可直接(jie)用(yong)不含(han)有(you)原核載體DNA片(pian)段的(de)外源(yuan)基因(yin)進(jin)行(xing)轉移(yi)；外源(yuan)基因(yin)的(de)長度(du)不受限(xian)制(zhi), 可達(da)100kb ；實(shi)驗周期(qi)相(xiang)對比較短。它(ta)的(de)不足(zu)之處是(shi) ：導入外源(yuan)基因(yin)整(zheng)合位點和拷貝數無(wu)法控制(zhi)；常導致插(cha)入位點附近(jin)宿(xiu)主(zhu)DNA 片(pian)段缺(que)失(shi)、重(zhong)組等(deng)突變，可造(zao)成動物(wu)嚴(yan)重的(de)生理(li)缺(que)陷。盡(jin)管如此，由於(yu)顯微(wei)註(zhu)射技(ji)術(shu)直接(jie)對(dui)基因(yin)進(jin)行(xing)操(cao)作(zuo)，整合率(lv)較高，因(yin)而仍是(shi)目(mu)前(qian)建立轉基因(yin)動物(wu)極(ji)為(wei)重要(yao)的(de)方法(fa)。

（二）顯微(wei)註(zhu)射法(fa)在(zai)植(zhi)物(wu)、動物(wu)的(de)細(xi)胞(bao)發育(yu)研究(jiu)的(de)應(ying)用(yong)：將(jiang)特定(ding)的(de)分子(zi)探(tan)針及衍(yan)生(sheng)的(de)細(xi)胞(bao)間質成分(fen)導入活體細(xi)胞(bao)，為(wei)研究(jiu)控(kong)制(zhi)細(xi)胞(bao)功(gong)能的(de)調控機(ji)制(zhi)提(ti)供了新的(de)視野(ye)。

（三(san)）顯微(wei)註(zhu)射法(fa)用(yong)於(yu)做(zuo)克隆(long)動物(wu)：供體細(xi)胞(bao)的(de)細(xi)胞(bao)核用(yong)顯微(wei)註(zhu)射器(qi)移(yi)入卵母細(xi)胞(bao)後，在(zai)卵(luan)母細(xi)胞(bao)相關因子(zi)的(de)作(zuo)用(yong)下，發生(sheng)了重編(bian)程(cheng)回復到(dao)發育(yu)的(de)起點狀(zhuang)態(tai)。核重編(bian)程(cheng)的(de)過程(cheng)就是(shi)使(shi)在(zai)體細(xi)胞(bao)中被(bei)關閉(bi)，而在(zai)正常胚(pei)胎發(fa)育(yu)中表達(da)的(de)基因(yin)重(zhong)新(xin)被(bei)激(ji)活的(de)過程(cheng)。

重編程有(you)三(san)種(zhong)可能的(de)結果：

1，供核基因(yin)組(zu)沒(mei)有(you)進(jin)行(xing)重編(bian)程，重(zhong)構胚很快(kuai)死(si)亡；

2，部分重(zhong)編程(cheng)，重構(gou)胚在(zai)不(bu)同(tong)的(de)發育(yu)階段(duan)死(si)亡 ；

3，重編程(cheng)，產(chan)生正常的(de)克隆(long)動物(wu)。

（四(si)）顯微(wei)註(zhu)射器(qi)可以實(shi)現單細(xi)胞(bao)提取：在(zai)不(bu)改(gai)變細(xi)胞(bao)生存環(huan)境(jing)的(de)情況下，用(yong)顯微(wei)註(zhu)射器(qi)對單個(ge)細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)活細(xi)胞(bao)提取。可單獨(du)提取細(xi)胞(bao)質或(huo)細(xi)胞(bao)核，或(huo)者(zhe)同(tong)時提(ti)取提(ti)取細(xi)胞(bao)質和細(xi)胞(bao)核。提取後(hou)細(xi)胞(bao)仍可存活(huo)。相比(bi)於(yu)傳(chuan)統的(de)裂(lie)解方式(shi)，用(yong)顯微(wei)註(zhu)射器(qi)提取的(de)樣(yang)本更為(wei)幹凈(jing)，可以得到(dao)很好地電(dian)鏡(jing)圖像(xiang)。

（五）顯微(wei)註(zhu)射法(fa)可以實(shi)現更優(you)的(de)CRISPR-Cas轉染方式(shi)：顯微(wei)註(zhu)射器(qi)能夠(gou)進(jin)行(xing)高速(su)、高效(xiao)地將(jiang)CRISPR-Cas復合物(wu)註(zhu)入細(xi)胞(bao)，幫助您克服(fu)對於(yu)傳(chuan)統方式(shi)極難轉染的(de)細(xi)胞(bao)基因(yin)編(bian)輯(ji)問(wen)題。

我(wo)們再(zai)介紹(shao)壹(yi)下顯微(wei)註(zhu)射法(fa)的(de)具體操(cao)作(zuo)過程(cheng)，顯微(wei)註(zhu)射實(shi)驗的(de)操(cao)作(zuo)需要(yao)在(zai)顯微(wei)鏡(jing)下進(jin)行(xing)，如圖(tu)所示：

（壹(yi)）在(zai)註(zhu)射針內裝液：使(shi)用(yong)無(wu)菌的(de)微(wei)量加樣(yang)器(qi)從微(wei)註(zhu)射針的(de)後部(bu)加入待註(zhu)射樣(yang)品。

（二）註射針安(an)裝和定位：

1， 將(jiang)裝液後(hou)的(de)針頭的(de)遊離(li)端安(an)在(zai)連(lian)接(jie)器(qi)上(shang)，然(ran)後旋(xuan)緊(jin)連(lian)接(jie)器(qi)以固(gu)定針頭，再(zai)將(jiang)其(qi)固定(ding)到(dao)微(wei)操(cao)作(zuo)儀(yi)的(de)托針管上(shang)。

2， 把(ba)載有(you)待註(zhu)射樣(yang)本的(de)培養皿放在(zai)顯微(wei)鏡(jing)載物(wu)臺(tai)上(shang)，用(yong)低倍物(wu)鏡(jing)對準(zhun)細(xi)胞(bao)調焦(jiao)；

3， 移(yi)動針頭並在(zai)顯微(wei)鏡(jing)下調整微(wei)操(cao)作(zuo)儀(yi)，直(zhi)到(dao)針頭的(de)陰影(ying)在(zai)視(shi)野(ye)的(de)中心(xin)上(shang)方(fang)；

4， 使(shi)用(yong)工作(zuo)用(yong)放大(da)倍(bei)數，調準(zhun)細(xi)胞(bao)焦(jiao)距(ju)，找到(dao)針尖。

（三(san)）顯微(wei)註(zhu)射：

1，使(shi)針尖對(dui)準(zhun)細(xi)胞(bao)的(de)待註(zhu)射部(bu)位（細(xi)胞(bao)與(yu)針尖在(zai)同(tong)壹(yi)焦(jiao)面(mian)上(shang)），旋(xuan)轉推進(jin)旋(xuan)鈕(niu)，針刺入細(xi)胞(bao)內（卵膜(mo)、細(xi)胞(bao)膜(mo)、核膜(mo)）。

2， 旋(xuan)轉加樣(yang)旋(xuan)鈕(niu)，將(jiang)樣(yang)本加入，並離(li)開細(xi)胞(bao)。

余下，就是(shi)將(jiang)操(cao)作(zuo)好的(de)細(xi)胞(bao)放回(hui)好好培養，實(shi)驗結束。

顯微(wei)註(zhu)射法(fa)的(de)缺(que)點是(shi)：實(shi)驗所需的(de)設備(bei)精密而昂貴、操(cao)作(zuo)技術(shu)需要長時間的(de)練習(xi)，以及(ji)每(mei)次只(zhi)能註射有(you)限(xian)的(de)細(xi)胞(bao)。